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18.03.2019

MADRID (Uypress) – A través de “miniscopios”, diminutos microscopios de fluorescencia colocados en la cabeza de animales, los científicos obtienen una imagen clara de la actividad neuronal mientras aquellos exploran e interaccionan con el entorno.

En los últimos años, el estudio de la actividad de grupos de neuronas ha experimentado un gran avance gracias al desarrollo de los miniscopios, unos microscopios en miniatura que, a modo de casco, se acoplan a la cabeza de los animales de experimentación, nos dice Michael Einsenstein, en una nota publicada en la revista Investigación y Ciencia.

Los dispositivos permiten visualizar el impulso eléctrico que atraviesa las neuronas en respuesta a un estímulo mientras el animal se mueve libremente, permitiendo de esta manera identificar los circuitos nerviosos que se activan durante determinadas conductas y procesos, como la fijación de la memoria, y también aquellos que fallan en los trastornos neurológicos

Tal como sucede, por ejemplo, con los ratones de Catherine Dulac, neurobióloga de Harvard. Mientras los animales exploran, el equipo de Dulac monitoriza minuciosamente en ellos determinados circuitos neuronales, y sigue el progreso de su actividad mediante un bloque de instrumentos adherido al cráneo.

El dispositivo: un microscopio de fluorescencia en miniatura acoplado a una lente y a una fina sonda endoscópica que se introduce en el cerebro.

"Las conductas sociales, por definición, se manifiestan cuando un individuo se mueve e interactúa con otros", explica Dulac. "La nueva técnica resulta clave para captar la actividad cerebral cuando un animal realiza una tarea que uno estudia."

Los investigadores que trabajan con roedores disponen desde hace casi veinte años de métodos para obtener imágenes in vivo de la actividad cerebral en animales despiertos. Pero estas técnicas al principio requerían inmovilizar la cabeza para conseguir una detección estable por fluorescencia. Por eficaces que fueran, las restricciones que imponían impedían llevar a cabo muchos estudios de comportamiento.

"Mi laboratorio aspiraba a adentrarse en nuevas áreas relacionadas con la exploración espacial y la conducta social", comenta Peyman Golshani, de la Universidad de California en Los Ángeles (UCLA). "Nos resultaba muy difícil adaptarnos a los sistemas que exigían la inmovilización de la cabeza."

Los rápidos e innovadores avances en el desarrollo de microscopios en miniatura permiten ahora formular preguntas fundamentales sobre el modo en que los circuitos neuronales gobiernan eventos cognitivos, conductuales y fisiológicos complejos, un paso crítico hacia la comprensión de los principios que subyacen a la organización y el funcionamiento del cerebro.

Todo ello ha motivado que la técnica haya sido declarada método del año 2018 por la revista Nature Methods.

Impacto profundo

El primer aparato de esas características, un módulo que constaba de un microscopio de fluorescencia de 1,1 gramos conectado a una cámara externa a través de cables de fibra óptica, fue desarrollado en 2008 por el grupo de Mark Schnitzer en la Universidad Stanford. El dispositivo monitorizaba sin interrupción las señales generadas por sensores de calcio codificados genéticamente (un indicador indirecto que suele emplearse para medir potenciales de acción) en subconjuntos escogidos de neuronas, señala la nota de Investigación y Ciencia.

El equipo de investigadores ha logrado perfeccionarlo de forma sustancial y lo ha comercializado a través de la empresa Inscopix, con sede en Palo Alto. El trabajo de Schnitzer atrajo la atención de numerosos científicos, entre ellos Golshani, quien quedó impresionado por sus posibilidades. Sin embargo, carecía de los recursos suficientes para comprar este elemento de hardware, que era bastante caro. Junto con sus colaboradores de la UCLA Alcino Silva, Bhaljit Khakh y Daniel Aharoni, creó una versión casera de código abierto del dispositivo de Schnitzer. "Terminó costándonos unos 1000 dólares", recuerda Golshani, que señala que su grupo ha colgado gratuitamente en Internet los diseños de su «miniscopio», así como el software asociado.

Antes de la aparición de estos dispositivos, los investigadores que estudiaban el cerebro durante la vigilia contaban con dos opciones principales. Podían obtener imágenes de alta resolución de neuronas individuales realizando una microscopía de excitación de dos fotones a través de una "ventana" en el cráneo de un animal inmovilizado. O bien, podían emplear técnicas de fotometría, en las que insertaban sondas de fibra óptica en el cerebro para monitorizar la fluorescencia asociada al calcio en una determinada región del tejido neuronal mientras el animal merodeaba sin impedimentos.

"La microscopía bifotónica transformó el campo, pero en la mayoría de los casos el comportamiento se ve restringido por la sujeción de la cabeza", comenta Anatol Kreitzer, de la Universidad de California en San Francisco. "Con la fotometría de fibra, el animal se mueve con plena libertad, pero no se consigue una buena resolución celular", dando cuenta de las limitaciones de ambas técnicas.

Los microscopios que, a modo de casco, se colocan en la cabeza, presentan numerosas ventajas. Por un lado, pueden captar imágenes de casi cualquier región del cerebro. Suelen utilizarse lentes de gradiente de índice con forma de varilla que se implantan quirúrgicamente en el sitio deseado antes de conectarla al microscopio en miniatura, lo cual permite obtener imágenes claras de tejidos que de otro modo serían inaccesibles. "En teoría, podría visualizarse cualquier región del cerebro; de hecho, ya se han alcanzado estructuras profundas, como la amígdala y el hipotálamo", comenta Da-Ting Lin, del Instituto Nacional sobre Drogadicción de EE.UU. Este logro reviste especial importancia porque muchas estructuras relacionadas con el comportamiento animal residen muy por debajo de la superficie de la corteza. "Estamos obteniendo imágenes de unas 200 neuronas en un momento dado, y lo hacemos con todos nuestros ratones durante varios meses", afirma Dulac.

Lectores de mente

La ventaja esencial de los microscopios colocados en el cráneo estriba en que, cuando los animales se liberan de su sujeción, resulta mucho más probable que se conduzcan con normalidad. Los experimentos en los que se inmoviliza la cabeza compensan esta restricción mediante el uso de herramientas de realidad virtual o de juegos de bolas, las cuales permiten a los ratones interactuar con su entorno. No obstante, este tipo de estrategias requieren un entrenamiento adicional y no siempre logran recoger por completo el comportamiento en el mundo real. En cambio, los microscopios en miniatura permiten llevar a cabo pruebas y diseños experimentales ampliamente contrastados en roedores. "Utilizamos lo que otras personas consideran paradigmas del comportamiento animal", explica Lin.

De acuerdo al equipo de Dulac, esta también constituye una excelente herramienta para analizar comportamientos sociales. Su equipo empleó el instrumento de Inscopix para identificar las neuronas en la amígdala media, una estructura situada en el cerebro profundo, las cuales se iluminan como respuesta a los estímulos olfativos asociados con crías jóvenes, ratones del sexo opuesto o depredadores. En un principio esperaba encontrar subconjuntos de células bien definidos que reaccionaran selectivamente a los distintos desencadenantes, pero, en su lugar, descubrió una complejidad y flexibilidad asombrosas en el modo en que se representa esta información. "La actividad de una población de neuronas proporciona la codificación precisa del estímulo concreto al que estuvo expuesto el animal. Además, advertimos diferencias entre machos y hembras", señala Dulac. Sorprendentemente, esas tendencias se veían acentuadas por las experiencias vitales; en especial, el apareamiento parecía agudizar las facultades discriminatorias. "Tras la cópula, los animales ven el mundo de modo muy distinto y continúan así durante mucho tiempo", afirma la neurobióloga. "Aunque debería decir "huelen" en lugar de "ven"." Un estudio de estas características, que depende de la monitorización prolongada de comportamientos complejos, habría sido inviable con los procedimientos que requieren la sujeción de la cabeza.

Fuentes: de O. Skocek et al. en Nat. Methods vol. 15, págs. 429-432, 2018, Springer Nature (ratón); de K. K. Ghosh et al. en Nat. Methods vol. 8, págs. 871-878, 2011, Springer Nature (Corte transversal del microscopio); de J. G. Parker et al. en Nature vol. 557, págs. 177-182, 2018, Springer Nature (miniscopio acoplado) Investigación y Ciencia.

Asimismo, resulta beneficioso que los animales deambulen con libertad en los estudios sobre memoria y aprendizaje, que a menudo examinan las interacciones con entornos familiares y desconocidos.

En la primera demostración publicada del miniscopio, el equipo de la UCLA utilizó el instrumento para demostrar una teoría sobre la codificación de la memoria que Silva había elaborado años atrás. "Se trata de un modelo muy específico que describe cómo vinculamos los recuerdos en el tiempo", explica. "La idea es que, cuando entra un recuerdo, se incorpora a un grupo de células que se activan con más facilidad durante un cierto período." Ello permitiría al cerebro establecer conexiones sólidas entre sucesos que guardan una relación estrecha y reducir las probabilidades de que se construyan falsas asociaciones. Con la obtención de imágenes de las células responsables de la memoria espacial en el hipocampo de ratones, Silva dotó de un soporte experimental a este modelo y demostró que los sucesos que ocurren en una sucesión más o menos rápida -en este caso, los cambios producidos en el entorno de la jaula y un estímulo inductor de miedo- se codifican con más fuerza y con una mayor superposición en el cerebro que los sucesos separados en el tiempo.

A primera vista, cabría suponer que el sueño podría estudiarse igual en un animal casi inmóvil que en uno sin ataduras, pero Yang Dan, de la Universidad de California en Berkeley, considera que este último constituye un mejor modelo para investigar la regulación del sueño y la vigilia. "Los ratones duermen mucho mejor y de forma más natural si gozan de libertad", afirma la neurocientífica. "Cuando se sujetan, necesitan mucho tiempo para habituarse." Mediante miniscopios, su equipo ha empezado a trazar mapas de los circuitos neuronales que incitan el sueño frente a aquellos que inducen la vigilia; también los han empleado para distinguir las poblaciones de células que facilitan la transición entre las fases de sueño MOR y no MOR. Dan señala que estos distintos tipos de células a menudo se entrelazan en una determinada región cerebral, lo cual desbarató los anteriores intentos de diseccionar los circuitos del sueño. "Con las nuevas imágenes, puede observarse un montón de neuronas del mismo animal simultáneamente, por lo que resulta más sencillo hacerse una idea de su distribución espacial", concluye.

La posibilidad de identificar los circuitos responsables del funcionamiento normal del cerebro también brinda a los investigadores un apoyo para entender qué falla en los trastornos neurológicos. "Siempre que haya un mecanismo complejo que resulte crítico y fundamental para la función cerebral, también existirá una dolencia asociada a él", sentencia Silva.

Los análisis efectuados por su equipo sobre la codificación de la memoria ya han aportado varias ideas sobre cómo el cerebro pierde la capacidad de almacenar información nueva con la edad.

Ello podría resultar relevante para comprender enfermedades como la demencia senil, o incluso la esquizofrenia. "Se sabe que las personas esquizofrénicas hacen asociaciones anómalas", apunta Silva. "Sospecho que los mecanismos que vinculan los recuerdos entre sí se interrumpen no solo al envejecer, sino probablemente también en los trastornos psiquiátricos."

En ese sentido, los miniscopios también facilitan las investigaciones sobre enfermedades relacionadas con el movimiento, como el Parkinson, para el que se conocen bien las estructuras cerebrales alteradas pero no la naturaleza de su disfunción.

En términos más generales, la posibilidad de llevar a cabo experimentos exhaustivos de neurociencia funcional en roedores podría reforzar su utilidad como modelo para trastornos neurológicos y psiquiátricos en humanos -una rehabilitación que debería haberse acometido hace tiempo, en opinión de Silva-. "Hemos acumulado una ingente cantidad de información concluyente sobre el funcionamiento del cerebro, pero, como comunidad, a menudo hemos fallado a la hora de convertir todo este conocimiento en tratamientos", explica, y añade que buena parte de la culpa ha recaído injustamente sobre los diminutos hombros de los ratones. "Se arguye que son muy diferentes de los humanos y que no sirven para predecir con suficiente certeza si algo funcionará." En fecha reciente, y para refutar estos argumentos, Silva y sus colaboradores han analizado los 40 medicamentos neuropsiquiátricos más vendidos y han descubierto que todos provocaban algún efecto en la conducta de los roedores.

Los modelos murinos de comportamiento (uso de cepas especiales de ratones para estudiar una enfermedad y cómo prevenirla y tratarla) nunca reflejarán a la perfección las complejas expresiones cognitivas que se perciben en los humanos, pero la capacidad de dirigirse directamente a los circuitos neuronales afectados y monitorizar su actividad podría tener un valor incalculable en la búsqueda de tratamientos más eficaces a la hora de atacar la raíz de un trastorno específico, sostienen.

Una imagen más nítida

El nuevo dispositivo se ha beneficiado de la existencia de herramientas robustas: los sensores de calcio fluorescentes, y también ha despertado un entusiasmo considerable el desarrollo de sensores codificados genéticamente que se activan en respuesta a un cambio de voltaje en las células, lo cual proporcionaría lecturas mucho más inmediatas y precisas de los impulsos neuronales, aunque la generación actual de sensores exigirá un esfuerzo paralelo nada desdeñable en el diseño de hardware. "Necesitan mucha luz y cámaras sumamente rápidas", apunta Kreitzer. Varios grupos también trabajan con indicadores fluorescentes que se iluminan en presencia de neurotransmisores específicos, como la dopamina, lo cual otorgaría acceso a una comprensión más profunda de la actividad cerebral.

Sin embargo, tal vez lo que mayor entusiasmo suscite provenga de la posibilidad de combinar esta técnica con la optogenética  (combinación de métodos genéticos y ópticos para controlar eventos específicos en ciertas células de tejidos vivos), elegida método del año 2010, con el fin de manipular determinados circuitos cerebrales escogidos a la vez que se observan las consecuencias funcionales directas.

En conjunto, la rápida evolución de esta técnica parecería poder anunciar, según el autor, una nueva forma de enfocar la neurociencia desde una perspectiva funcional integrada, a nivel de sistema, en lugar de abordarla con los métodos conductuales macroscópicos o las estrategias moleculares y celulares microscópicas que predominan en la actualidad.

En opinión de Silva, el objetivo radica nada más que en vislumbrar el "código fuente" del cerebro. "Tras la complejidad del universo, existen leyes muy sencillas, como 'F = ma'", asegura. "En biología hemos de descubrirlas y conectarlas con los principios de ingeniería que lo unieron todo."

Fuente: Investigación y Ciencia

(*) Artículo original publicado en Nature Methods, vol 16, pags 5-8, enero 2019.